尼康工具顯微鏡調焦的目的是將顯微鏡的物方焦平面調整到與被測的物平面重合；這時，物體的像將清晰地成在目鏡分劃板上。由于在這之前，已經做了目鏡視度調整，因此，觀察到的像和分劃板同時清晰。
檢查調焦是否正確的方法很簡單，先移動X、Y坐標使輪廓像與分劃板刻線重合，然后眼睛相對目鏡上下或左右稍微移動，觀察輪廓像相對分劃板刻線是否有相對移動。如果有，則說明二者不在同平面上，存在視差。
調焦時，眼部肌肉定要放松，盡量不要帶眼鏡，視力的差異用調節目鏡視度來彌補。初學者往往在用只眼觀察時，不自覺地閉上另只眼，這不利于眼部肌肉放松。要養成睜開雙眼的習慣。思想集中在瞄準的那只眼，另只眼的干擾像自然會“視而不見”。
對于安裝在針架上的圓柱體、圓錐體和螺紋類零件，靠直接觀察零件成像清晰度來調焦，往往不夠，須借助儀器所帶的“定焦桿”來調焦。
尼康工具顯微鏡光源位置的調整：
此項調整，應在更換照明發光器件后進行。其程序為：
1.將塊較薄的白紙放在底光照明聚光鏡上方。
2.打開底光照明開關，并把亮度旋鈕打到大；儀器的光欄刻度盤也打到大處。
3.調整燈座外套上的螺釘，使照明亮斑位于聚光鏡中央。
4.松開燈座鎖緊螺釘，推拉燈座，使出光口剛被亮斑充滿，鎖緊螺釘，撤掉白紙，調低亮度。
尼康工具顯微鏡使用，發光器件位置可能會走動，應經常檢查，及時調整。有些采用LED做發光器件，亮斑不能調整，只須調整亮斑大小。
